Fu eretta su progetto di Giorgio Vasari nel 1565-68 come chiesa dei Cavalieri dell’Ordine di Santo Stefano.  Il campanile, progettato anch’esso dal Vasari, è del 1570-1572. La facciata marmorea fu progettata da Giovanni de’ Medici nel 1602. L’interno, originariamente ad aula unica con aggiunte dei corpi laterali nel 1683-1688 su progetto di Pier Francesco Silvani, ha un ricco soffitto ligneo dorato con tele raffiguranti le imprese militari dell’Ordine.

Tra i numerosi trofei di guerra che adornano la chiesa spicca la preziosa serie di bandiere, in gran parte conquistate ai turchi durante i ripetuti scontri navali, realizzate tra la metà del XVI e gli inizi del XVIII secolo, insieme ad antichi fanali di navi collocati tra le ampie finestre. Sempre in controfacciata e lungo le pareti sono cinque dipinti a monocromo, con 'Storie di Santo Stefano papa e martire', unica preziosa testimonianza dell'addobbo allestito per celebrare l'ingresso in città del granduca Ferdinando II (31 marzo 1588), cui si deve la commissione del prezioso soffitto ligneo, intagliato e dorato dall'intagliatore Bartolomeo Atticciati (1604).